ТАЙНА ЛЯЛИУСОВ, ИЛИ ЧТО ЭТО ЗА ШТУКА ТАКАЯ - ИРИДОВИРУС

[administrator 62]

ТАЙНА ЛЯЛИУСОВ,
ИЛИ ЧТО ЭТО ЗА ШТУКА ТАКАЯ - ИРИДОВИРУС

Лялиусы. Сolisa lalius (также - Сolisa laliа, Trichogaster lalius). Красивые, интересные, мечта многих аквариумистов…  

Представители вида распространены в дельтах рек  Пакистана, на севере Индии и Бангладеша. Природные популяции обнаруживаются также в Сингапуре, Колумбии, США. Однако «дикарей» практически невозможно увидеть в аквариумах. Большинство рыбы, поступающей на продажу, выращивается на рыбоводческих фермах – давно налаженная практика.

Но сколько печальных сообщений о быстрой гибели лялиусов вскоре после приобретения! Даже у опытных аквариумистов – месяц, другой, полгода… И все. Иногда симптомы очевидны – «прыщики», опухоли, язвенные эрозии, взъерошенная чешуя, раздутое асцитное брюшко… И в итоге – гибель рыбки. Иногда же рыба гибнет внезапно, без всяких признаков болезни. Положение усугубляется тем, что ни один из известных в аквариумистике препаратов не может ничего изменить в ситуации. В результате среди аквариумистов возникло и все больше укрепляется мнение о том, что лялиусы погибают от «непонятной генетической болезни», что болезнь эта неизлечима и «передается чуть ли не на стадии икры», что у лялиусов «что-то с иммунитетом». Говорится даже о «генетической предрасположенность лялиусов к некоему вирусу». В общем, намешано всего и всякого – непонятного и страшного! Надо разбираться, где правда, а где домыслы…

В 2002 году японскими исследователями было сделано сообщение о том, что партия декоративных тропических рыб, среди которых был и  Сolisa lalius, выращенная в Малайзии и импортированная через сингапурских оптовиков, была заражена иридовирусной инфекцией (iridovirus) [Sudthongkong C., Miyata M., 2002]. О вспышках системных заболеваний лялиусов, вызванных иридовирусом, было заявлено и другими исследователями [Paperna I., Vilenkin M., 2001; Go J., Lancaster M., 2006; Kim W.S., Oh M.J., 2010; Rimmer A.E., Becker J.A.,2015].

То, что инфекция тропического иридовируса вызывает тяжелые эпизоотии, которые приводят к массовой гибели рыб, стало известно еще в 90-х г прошлого столетия. После инфицирования рыбы становятся вялыми, у них проявляется тяжелая анемия, петехии жабр и увеличение селезенки. Гистологическое исследование всех тропических iridovirus-инфицированных рыб показало системное формирование включений, образованных несущими тельца клетками (inclusion body-bearing cells – IBCs), некроз инфицированных вирусом спленоцитов (клеток селезенки) и гемопоэтических клеток [Sudthongkong C., Miyata M., 2002 (1,2)].

В настоящее время хорошо изучены цитологические особенности IBCs, на которые можно опираться при лабораторной диагностике иридовирусной инфекции. На ранней стадии IBCs проявляются как гипертрофированные бласто-подобные клетки с базофильной цитоплазмой и центрально расположенными увеличенными  ядрами, содержащими заметные ядрышки. Зрелые IBCs увеличены, имеют амебоподобную форму и содержат только базофильные включения (basophilic inclusion body). При этом цитоплазма и ядро клетки-хозяина бывают незначительно сжаты. Раздутые дегенерирующие IBCs содержат зернистые включения в умеренно сжатой и узкой цитоплазме, а также  сморщенные фрагментированные ядра [Ketut Mahardika, Zafran, 2004].

Электронная микрофотография, показывающая вирионы в пораженной клетке селезенки больной рыбы.  (А) Видны детали зрелых IBC. В зонах скопления вирусов (virus assembly site - VAS) содержится масса гексагональных вирионов размером от 180 до 200 нм. (В) Высвобождение зрелых вирионов в уплотненную цитоплазму клетки-хозяина. Зона VAS содержит  тонкие (f) и грубые (r) гранулы.  (С) Детальное изображение тонких гранул и гексогональных вирионов в зоне скопления. (D) Балонированное IBC. Все органеллы клетки хозяина  деградированы, фрагментированы и смешаны с массой вирионов и гранулярных включений.  [Ketut Mahardika, Zafran, 2004]

В разное время штаммы иридовирусов были выделены у различных видов рыб. На основании межвидового расхождения определенных признаков заболевания (гистологических, микроскопических и др.), был сделан вывод, что иридовирусная инфекция, обнаруженная у определенного вида рыб,  вызывает самостоятельное заболевание, присущее только данному виду. К числу таких заболеваний, вызываемых иридовирусной инфекцией, были отнесены:

- вирусное некротическое поражение селезенки и почек (infectious spleen and kidney necrosis virus – ISKNV),
- iridovirus трески Мюррея (Murray cod iridovirus – MCIV),
- иридовирусное заболевание красного морского леща (red sea bream iridovirus – RSIVD),
- iridovirus краснотелого палтуса ( turbot reddish body iridovirus – TRBIV),
- iridovirus Тайваньского окуня (Taiwan grouper iridovirus – TGIV),
- iridovirus морского окуня (SBIV),
- iridovirus скалистого леща (rock bream iridovirus – RBIV),
- иридовирусная сонная болезнь окуня (grouper sleepy disease iridovirus  – GSDIV),
- iridovirus лялиусов (dwarf gourami iridovirus  – DGIV),
- iridovirus африканских lampeye (African lampeye iridovirus – ALIV)
[Nakajima K., Kunita J., 2005; Kim W.S., Oh M.J., 2010; Kurita J., Nakajima K., 2012; Rimmer A.E., Becker J.A.,2015].

Однако позже было замечено, что иридовирус, вызывающий заболевание одного вида рыб, способен поражать и другой вид. Так, экспериментальное инфицирование иридовирусами, выделенными из африканских lampeye (ALIV), показало патогенность данного возбудителя для жемчужного гурами Trichogaster leeri [Sudthongkong C., Miyata M., 2004]. Iridovirus Тайваньского окуня  (TGIV) оказался способен заразить морского окуня из рода Epinephelus и гибрид морского окуня (красный пятнистый окунь Epinephelus akaara × Малабарский окунь) [Ketut Mahardika, Zafran, 2004].

С помощью ПЦР-анализа генов вирусной АТФ-азы и генов, кодирующих белки вирусного капсида (МСР), удалось установить генетическую идентичность вирусов, вызывающих названные выше заболевания у  различных видов рыб. Так, было показано, что идентичность ALIV и DGIV составляет 95.3% [Sudthongkong C., Miyata M., 2002]. Высоко гомологичными (>95.8%, >94.9% идентичности) оказались гены АТФ-азы и МСР иридовирусов, выделенных из 5 видов зараженных рыб  – морского окуня из Южно-китайского моря, красного морского леща в Японии, коричнево-пятнистого морского окуня с сонной болезнью из Таиланда, лялиусов из Малайзии, Африканских lampeye с островов Суматра и Индонезия [Sudthongkong C., Miyata M., 2002]. Была выявлена  практически полная гомология (99.95%) более 4,527 пар оснований  между иридовирусом трески Мюррея (MCIV) и иридовирусом Colisa lalia (DGIV), а также вирусом, вызывающим  некроз при инфекционной болезни селезенки и почек (ISKNV) [Go J., Lancaster M., 2006].

Видимо эти и подобные сообщения и породили миф о «генетическом заболевании» и о «предрасположенности к вирусу». Чтобы пояснить, в чем  ошибка этих предположений, необходимо вспомнить о биологии вирусов.

Вирус – это неклеточная форма жизни, некий конгламерат из органических молекул, способный воспроизводиться. Но воспроизводиться он может только внутри живых клеток, для чего вирус  внедряется в них извне.

Зрелые вирусные частицы (вирионы) обычно состоят из генетического материала (ДНК или РНК) и окружающей его белковой оболочки (капсида).  Капсид состоит из белков, кодируемых вирусным геномом, а его форма лежит в основе классификации вирусов по морфологическому признаку.

Для размножения и образования множественных копий самих себя вирусы используют ресурсы клетки-хозяина. Сначала зрелый вирус прикрепляется к клетке хозяина. Между белками вирусного капсида и белками на поверхности клетки-хозяина происходит специфичное связывание. Благодаря этому вирус инфицирует только определенные клетки, т.е. может поражать клетки одних организмов и не способен поражать клетки других. Далее вирус вводит свой генетический материал (ДНК или РНК) внутрь клетки хозяина. Способ введения может быть различным и зависит от природы вируса и клетки-хозяина (растения, бактерии, животные). При этом происходит отделение вирусного генома от капсида. Капсид либо остается снаружи клетки, либо разрушается с участием ферментов внутри клетки.

Проникший в клетку геном вируса запускает механизмы синтеза белка, используя клеточные ресурсы, но по своей, вирусной генетической информации. Т.е. пораженная вирусами клетка начинает производить вирусные белки, которые впоследствии будут использованы для строительства капсида. Сам же вирусный геном создает многочисленные копии – опять же используя ресурсы клетки-хозяина. Иногда вирусная ДНК встраивается (интегрируется) в ДНК клетки-хозяина и размножается (дуплицируется) вместе с ним. Из синтезированных клеткой-хозяином вирусных белков и размноженной во многих копиях вирусной ДНК происходит сборка  новых, «дочерних» вирионов. Потомство вирусов покидает использованную клетку, которая в итоге оказывается поврежденной или полностью разрушенной, и заражает новые клетки.

Таким образом, упомянутые выше гены АТФ-азы и МСР были выделены из клеток зараженных рыб, но принадлежали вирусам.

Молекулярно-генетическими исследованиями на основе ПЦР-анализа было доказано, что иридовирусы, выделенные у различных тропических рыб из разных географических регионов, имеют единую природу, а  происхождение инфекции идет из Юго-Восточной Азии. Тем не менее, изученные гены тропических вирусов намного отличались от таковых, выявленных у представителей других родов – Cloriridovirus, Ranavirus, Lymphocystivirus и Iridovirus – в семействе Iridoviridae. Так, хотя RSIV изначально был определен как iridovirus, анализ его генов показал, что вирус не принадлежит ни к одному из четырех известных родов в пределах семейства Iridoviridae. Поэтому было предложено классифицировать тропические иридовирусы как новый род в семействе Iridoviridae. [Sudthongkong C., Miyata M., 2002]. Таким образом, был открыт пятый род, названный Megalocytivirus, и показана реальная причина наличия увеличенных базофильных клеток в инфицированных органах.

Характерная разница в генетическом составе Мegalocytiviruses и других родов семейства  Iridoviridae  заключается наличии генов, кодирующих большие и малые субъединицы вирусной рибонуклеотид-редуктазы (РР-1, РР-2). Megalocytiviruses содержат только ген РР-2, в то время как другие роды содержат гены, кодирующие как РР-1, так и РР-2 [Kurita J., Nakajima K., 2012].

В 2015 году австралийскими учеными была проведена оценка инфицированности декоративных рыб – импортируемых, местно разведения и дикорастущих [Rimmer A.E., Becker J.A.,2015]. С помощью количественной ПЦР образцы проб были протестированы на наличие megalocytivirus. Megalocytivirus был обнаружен у десяти из четырнадцати видов декоративных рыб. При этом megalocytivirus был выявлен у 18.7% рыбы, помещенной в карантин, и у 68.6% рыб, умерших во время карантинного периода. У австралийских оптовиков рыбы были заражены в 14.5% и 21,9% случаев, соответственно.  У декоративных рыб местного разведения ISKNV (вирусное некротическое поражение селезенки и почек) – как megalocytivirus – был обнаружен в 1,1% среди Xiphophorus maculatus. В свободноживущей  популяции голубого гурами Megalocytivirus не был обнаружен [Rimmer A.E., Becker J.A.,2015].

Таким образом, исследованиями было доказано, что импортные декоративные рыбы являются переносчиками вирусной инфекции семейства Iridoviridae, в том числе и DGIV – иридовируса, вызывающего то самое таинственное «генетическое» заболевание лялиусов.

P.S.

Наряду с иридовирусом существует другой распространенный вид вирусов – вирус некроза нервной системы (NNV). И хотя NNV и иридовирус относятся к разным типам вирусов – первый содержит в качестве генома одноцепочную РНК, а второй – двухцепочную ДНК, между ними имеется определенная параллель: оба приводят к  серьезным заболеваниям и высокой смертности зараженной рыбы. Кроме того, оба вируса были найдены у молоди рыб, в том числе и на самых ранних этапах развития.

C помощью чувствительного метода (ПЦР в реальном времени) было установлено, что NNV локализован находится внутри эмбриона. При этом вирусы продолжают репликацию размножаться во время эмбрионального развития. Во время развития эмбрионов количество вирусных частиц увеличивается и продолжает нарастать даже после вылупления мальков из икры.

Одно время предполагалось, что при передаче вирусов главную роль может играть поверхность икринок [Grotmol S., Totland G.K., 2000]. Также сообщалось, что вирус NNV может содержаться в сперме рыб или же быть интегрированным встроенным в клеточный геном. Недавними исследованиями [Hsiao-CheKuo, Ting-Yu Wang, 2012] было показано, что в неоплодотворенных икринках, полученных от инфицированных зараженных вирусом самок морского окуня, NNV не был обнаружен. Исходя из этого, был сделан вывод, что вирус может проникнуть в яйцо либо внутриутробно – во время формирования икры, либо уже во внешней среде – при оплодотворении сперматозоидами.

Однако в некоторых исследованиях было показано, что передача вирусов от родителей потомству не всегда имеет место. К примеру, было известно, что иридовирус белого осетра (WSIV) передается потомству от взрослой рыбы, и что дикие взрослые особи являются носителями этого вируса. Тем не менее J.D.Drennan продемонстрировал, что не все дикие производители осетровых, зараженные иридовирусом, производят WSIV-положительное потомство [ Drennan J.D., LaPatra S.E., 2006].

Как бы то ни было, для NNV были подтверждены возможность проникновения вируса в половые продукты рыб (яйцеклетки и сперматозоиды), возможность передачи инфекции от родителей потомству (так называемая вертикальная передача), а также наличие инфекции (увеличение количества вирусов) при эмбриональном развитии рыб.

Естественно, с подтверждением гипотезы о вертикальной передаче данной инфекции, начали изыскивать и возможность борьбы с вирусами на ранних стадиях развития рыбы. Методы обработки икры с использованием озона, йода или других химических веществ, основанные на предположении об адсорбции вирионов на поверхности яйцеклеток, несколько снизили смертность среди зараженных рыб, но не принесли впечатляющих успехов [Grotmol S., Totland G.K., 2000;  Drennan J.D., LaPatra S.E., 2006]. Интересные результаты были получены после реализации программы вакцинации  маточных стад окуня (Epinephelus tukula) против NNV: 5 месяцев спустя вирус был обнаружен в икре невакцинированных рыб, тогда как в икре вакцинированных рыб он не был найден [Kai Y.H., Su H.M., 2010].

P.P.S.

Способы борьбы с вирусами ищутся давно. Сколько всего уже перепробовано! И химия, и облучение, и температурные воздействия… А вирусы продолжают свой победный марш. Клетку (например, клетку патогенной бактерии, вызывающей заболевание) можно убить каким-либо веществом, которое способно заблокировать определенное звено в сложной системе обмена веществ. С вирусами такой номер не пройдет. Как было сказано выше, вирусы – неклеточная форма жизни. Поэтому у вирусов нет собственной системы жизнеобеспечения, которая есть в любой живой клетке и которую можно было бы вывести из строя.

Теоретически у вируса можно вывести из строя только гены – которые, например, кодируют упомянутые вирусную АТФ-азу или капсулярные белки. А выведение генов из строя возможно за счет нарушения их структуры или работы. Т.е., та самая страшная притча во языцех – генетическая модификация ))) Но когда вирус уже попал в организм и начал свою разрушительную деятельность, особого смысла в ней уже нет. А вот для другого она может и пригодиться – для создания новейших генно-инженерных вакцин… Но об этом чуть позже.

Эффективным способом борьбы с большинством заболеваний, вызываемых вирусами, на сегодняшний день является вакцинация. Не стал исключением и иридовирус. Коммерческие потери в регионах, где он свирепствовал, были настолько велики, что разработка действенной вакцины стала насущной проблемой. И такая вакцина была создана. Первым делом – формалин-инактивированная вакцина против иридовируса красного морского леща (RSIV). Принцип работы такой вакцины заключается во введении в организм рыбы убитого (в данном случае формалином) возбудителя – иридовируса. В ответ на это организм рыбы вырабатывает антитела, которые узнают этот и только этот вирус. В дальнейшем при проникновении в организм уже живых иридовирусов, антитела очень быстро распознают их, что помогает иммунной системе в кратчайшее время инактивировать вирионы.

Последовало множество сообщений о практической оценке формалин-инактивированной вакцины [NakajimaK., Maeno Y., 1999].  В одном из исследований молодь морского леща прививали внутрибрюшинно, выдерживали неделю, затем переводили в общий резервуар и наблюдали в течение 12 недель. Об эффективности судили, сравнивая гибель в группах вакцинированных и невакцинированных рыб. Общая смертность, вызванная RSIVD в группе привитых и непривитых рыб, составила 19,2 и 68,5%, соответственно. Аналогичные результаты показали и другие исследователи [Nakajima K., Kunita J., 2005;  Mahardika K.,   Haryanti,   2008;   Kurita J.,   Nakajima K., 2012].

Позже были разработаны инактивированные вакцины против иридовирусов, выделенных их других видов рыб [Kurita J., Nakajima K., 2012]. Но недостатком инактивированных (убитых) вакцин является то, что они стимулируют слабый иммунный ответ, так что требуется несколько повторных ревакцинаций. Вероятно этим объясняется высокий, но не 100% эффект применения данной вакцины. Тем не менее, формалин-инактивированная вакцина в настоящий момент стала коммерческой и уже имеется в свободной продаже в ряде стран [Nakajima K., Kunita J., 2005; Kurita J., Nakajima K., 2012].

Однако поиски эффективной вакцины на этом не остановились, тем более с появлением современных биотехнологических возможностей.

Была показана эффективность генно-инженерной  вакцины, или так называемой субъединичной  вакцины,  состоящей из фрагментов вируса, способных обеспечить адекватный иммунный ответ. В качестве субъединичной вакцины были использованы три белка капсида иридовируса – 18Р, 351R и основной капсульный белок. Гены, кодирующие эти три иридовирусных белка, были встроены в геном кишечной палочки (E.coli), которая стала, таким образом, рекомбинантной. Инактивированную формалином рекомбинантную кишечную палочку с фрагментами генома иридовируса вводили молоди красного морского леща. Привитые рыбы показали значительно большую выживаемость, чем неиммунизированные [Shimmoto H., Kawai K., 2010].

Также исследуются вакцины, в которых гены иридовируса, провоцирующие иммунный ответ, вносятся в организм рыбы с помощью других молекулярно-биологических носителей, таких например, как плазмидная ДНК [CaipangC.M., Takano T., 2006; Ou-yang Z., Wang P., 2012].

Тем не менее, все эти исследования представляют пока больше теоретический интерес. А практика… Практика говорит, что проблема все еще существует, и реальные меры по контролю распространения иридовируса рыб больше направлены на профилактику. В этой связи в ряде стран были введены специальные государственные регламетации. В частности, в Австралии пересмотрены некоторые положения национальной политики био-безопасности, и с 1 марта 2016 года для ввоза рыб, восприимчивых к иридовирусу, требуется сертификат, удостоверяющий  отсутствие этой инфекции у партии ввозимых рыб [Rimmer A.E., Becker J.A., 2015].

Литература, использованная при подготовке статьи:

1. Caipang C.M., Takano T., Hirono I., Aoki T.  Genetic vaccines protect red seabream, Pagrus major, upon challenge with red seabream iridovirus (RSIV) // Fish Shellfish Immunol. –2006, Aug. –21(2). –Р.130-138.

2. Drennan J.D., LaPatra S.E., Siple J.T., Ireland S., Cain K.D. Transmission of white sturgeon iridovirus in Kootenai River white sturgeon Acipenser transmontanus // Dis Aquat Organ. –2006, Jun 12. –70(1-2). –Р.37-45.

3. Go J., Lancaster M., Deece K., Dhungyel O., Whittington R. The molecular epidemiology of iridovirus in Murray cod (Maccullochella peelii peelii) and dwarf gourami (Colisalalia) from distant biogeographical regions suggests a link between trade in ornamental fish and emerging iridoviral diseases // Mol Cell Probes. –2006, Jun-Aug. –20(3-4). –Р.212-222.

4. Grotmol S., Totland G.K. Surface disinfection of Atlantic halibut Hippoglossus hippoglossus eggs with ozonated sea-water inactivates nodavirus and increases survival of the larvae // Dis Aquat Organ. –2000, Jan 14. –39(2). –Р.89-96.

5. Hsiao-Che Kuo,Ting-Yu Wang, Hao-Hsuan Hsu, et al. Nervous Necrosis Virus Replicates Following the Embryo Development and Dual Infection with Iridovirus at Juvenile Stage in Grouper // PLoS One. –2012. –7(4). –e36183.  (doi:  10.1371/journal.pone.0036183)

6. Kai Y.H., Su H.M., Tai K.T., Chi S.C. Vaccination of grouper broodfish (Epinephelus tukula) reduces the risk of vertical transmission by nervous necrosis virus // Vaccine. –2010, Jan 22. –28(4). –Р.996-1001. (doi: 10.1016/j.vaccine.2009.10.132)

7. Ketut Mahardika, Zafran, Asami Yamamoto, Teruo Miyazaki. Susceptibility of juvenile humpback grouper Cromileptes altivelis to grouper sleepy disease iridovirus (GSDIV) // DISEASES OF AQUATIC ORGANISMS. –2004. –Vol. 59. –Р. 1–9.

8. Kim W.S., Oh M.J., Kim J.O., Kim D., Jeon C.H., Kim J.H. Detection of megalocytivirus from imported tropical ornamental fish, paradise fish Macropodus opercularis // Dis Aquat Organ. –2010, Jul 1. –90(3). –Р.235-9. (doi: 10.3354/dao02232.)

9. Kurita J., Nakajima K. Megalocytiviruses // Viruses. –2012, Apr. –4(4). –Р.521-538. (doi: 10.3390/v4040521)

10. Mahardika K., Haryanti, Muzaki A., Miyazaki T.  Histopathological and ultrastructural features of enlarged cells of humpback grouper Cromileptes altivelis challenged with Megalocytivirus (family Iridoviridae) after vaccination // Dis Aquat Organ. -2008, Apr 1. –79(2). –Р.163-168. (doi: 10.3354/dao01896.)

11. Nakajima K., Maeno Y., Honda A., Yokoyama K., Tooriyama T., Manabe S. Effectiveness of a vaccine against red sea bream iridoviral disease in a field trial test // Dis Aquat Organ. –1999, Apr 15. –36(1). –Р.73-75.

12. Nakajima K., Kunita J. Red sea bream iridoviral disease // Uirusu. –2005, Jun. –55(1). –Р.115-25.

13. Ou-yang Z., Wang P., Huang Y., Huang X., Wan Q., Zhou S., Wei J., Zhou Y., Qin Q.  Selection and identification of Singapore grouper iridovirus vaccine candidate antigens using bioinformatics and DNA vaccination // Vet Immunol Immunopathol. –2012, Sep 15. –149(1-2). –Р.38-45. (doi: 10.1016/j.vetimm.2012.05.021.)

14. Рaperna I., Vilenkin M., de Matos A.P. Iridovirus infections in farm-reared tropical ornamental fish // Dis Aquat Organ. –2001, Dec 20. –48(1). –Р.17-25.

15. Rimmer A.E.,  Becker J.A.,  Tweedie A., Lintermans M., Landos M.,  Stephens F.,  Whittington R.J. Detection of  dwarf  gourami  iridovirus  (Infectious spleen and kidney necrosis virus) in populations of ornamental fish prior to and after importation into Australia, with the first evidence of infection in domestically farmed Platy (Xiphophorus maculatus) // Prev Vet Med. –2015, Nov 1. –122(1-2). –Р.181-194.

16. Shimmoto H., Kawai K., Ikawa T., Oshima S. Protection of red sea bream Pagrus major against red sea bream iridovirus infection by vaccination with a recombinant viral protein // Microbiol Immunol. –2010, Mar. –54(3). –Р.135-142. (doi: 10.1111/j.1348-0421.2010.00204.x.)

17. Sudthongkong C., Miyata M., Miyazaki T. Viral DNA sequences of genes encoding the ATPase and the major capsid protein of tropical iridovirus isolates which are pathogenic to fishes in Japan, South China Sea and Southeast Asian countries // Arch Virol. –2002, Nov. –147(11). –Р.2089-2109.

18. Sudthongkong C., Miyata M., Miyazaki T. Iridovirus disease in two ornamental tropical freshwater fishes: African lampeye and dwarf gourami // Dis Aquat Organ. –2002, Apr 5. –48(3). –Р.163-173.

19. Sudthongkong C., Miyata M., Miyazaki T.  Iridovirus disease in two ornamental tropical freshwater fishes: African lampeye and dwarf gourami // Dis Aquat Organ. –2002, Apr 5. –48(3). –Р.163-73.

 

Юю (с) 2016